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濾光片在流式細胞儀中的應用

更新時間:2020-01-09 點擊次數:2066
  流式細胞儀(flow cytometry,FCM)是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀,是在單個細胞分析和分選基礎上發展起來的對細胞的物理或化學性質(如大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等)進行快速測量并可分類收集的高技術。
 
  工作原理簡介:采用激光作為激發光源,其具有更好的單色性與激發效率;利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術,檢測的靈敏度和特異性;用計算機系統對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數信號進行數據處理分析,了檢測速度與統計分析性。
 
  流式細胞儀主要由以下五部分構成:①流動室及液流驅動系統;②激光光源及光束形成系統;③光學系統;④信號檢測與存儲、顯示、分析系統;⑤細胞分選系統。
 
  其中激光光源及光束形成系統:流式細胞儀可配備一根或多根激光管,常用的激光管是氬離子氣體激光管,它的發射光波長488nm,此外可配備氦氖離子氣體激光管(波長633nm)和/或紫外激光管。
 
  流式細胞儀的主要測定信號熒光是由激發光激發的,熒光信號的強弱與激發光的強度和照射時間相關,激光是一種相干光源,它能提供單波長、高強度、高穩定性的光照,正是能達到這一要求的理想的激發光光源。
 
  在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡,將激光光源發出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束(22μm×66μm),在這種橢圓形激光光斑內激光能量成正態分布,使通過激光檢測區的細胞受照強度一致。
 
  光學系統由若干組透鏡、小孔、濾光片組成,大致可分為流動室前和流動室后兩組。
 
  流動室前的光學系統由透鏡和小孔組成,透鏡和小孔(一般為2片透鏡、1個小孔)的主要作用是將激光光源發出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束,使激光能量成正態分布,使通過激光檢測區的細胞受照強度一致,大限度的減少雜散光的干擾;流動室后的光學系統主要由多組濾光片組成,濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。
 
  濾光片主要有三類:長波通(LPF)--只允許特定波長以上的光線通過,短波通(SPF)--只允許特定波長以下的光線通過,帶通(BPF)--只允許特定波長的光線通過,不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管(PMT),如接收綠色熒光(FITC)的PMT前面配置的濾光片是LPF550和BPF525,接收色橙紅色熒光(PE)的PMT前面配置的濾光片是LPF600和BPF575,接收紅色熒光(CY5)的PMT前面配置的濾光片是LPF650和BPF675。
 
  流式細胞儀發明的初期,主要應用在對細胞的分選上,隨著計算機技術,免疫學的發展以及單克隆抗體技術的發明,隨后才在生物學和醫學、藥學等領域的應用越來越廣泛,如細胞動力學分析、細胞調亡、細胞分型、腫瘤的診斷、藥物療效分析等許多領域。近年來,新型多功能流式細胞儀的開發,多參數分析技術的建立,以及各種功能強大的分析軟件的開發等,為流式細胞儀檢測結果性的提高和分析能力的擴展提供了保障,可以相信,在未來生物學和醫學領域,流式細胞儀的應用范圍會進一步擴大,應用深度會進一步加強。

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