TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)，全內(nèi)反射熒光顯微鏡，利用光從高折射率的介質進入較低折射率的介質時，如果入射角足夠大時則光全部被反射而不發(fā)生折射，但是在兩種介質的界面會產(chǎn)生衰逝波可以激發(fā)近界面100nm范圍內(nèi)的熒光的原理來實現(xiàn)對物體表面的觀察。可通過常規(guī)熒光顯微鏡的照明器或特殊照明器送入激發(fā)光，并對激光的入射角度進行控制，采用瞬間場激發(fā)方法以避免激發(fā)光進入探測器，在玻璃和水界面的激發(fā)光產(chǎn)生全內(nèi)反射實現(xiàn)的。因為激發(fā)光呈指數(shù)衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會產(chǎn)生熒光反射，大大降低了背景光噪聲干擾觀測標的，故此項技術廣泛應用于細胞表面物質的動態(tài)觀察。
 

全內(nèi)反射熒光顯微鏡 (TIRFM)示意圖
 

　　①樣品 ②損耗波范圍 ③蓋玻片 ④浸鏡油 ⑤目標 ⑥發(fā)射光束(信號) ⑦激發(fā)光束
 

　　為了實現(xiàn)全內(nèi)反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61度。這可以通過棱鏡(prism)實現(xiàn)，稱為棱鏡型TIRFM(prism-based TIRFM)，也可通過高數(shù)值孔徑的物鏡實現(xiàn)，此時稱為物鏡型TIRFM(objective-type TIRFM)。現(xiàn)在商品化的全內(nèi)反射熒光顯微鏡一般都是物鏡類型的，速度快，精度高。
 

　　全內(nèi)反射熒光顯微鏡由于能實現(xiàn)物體表面非常薄范圍內(nèi)(小于100nm)熒光觀察，故在某些生物領域得到廣泛應用。如以下等應用：
 

　　細胞表面圖象的觀察：細胞膜表面結構、細胞表層的接觸、膜表面動力學/蛋白質定位。
 

　　單分子觀察及其操作：肌球蛋白、肌動蛋白與Cy3標記ATP。
 

　　細胞膜表面運動：如泡吞、泡吐現(xiàn)象，泡外分泌現(xiàn)象。
 

　　細胞膜鈣火花現(xiàn)象的觀察，離子通道監(jiān)視。
 

　　分子馬達研究：旋轉的馬達、細胞骨架蛋白、聚合體、G蛋白、環(huán)狀蛋白、核苷酸馬達。
 

　　除了在生物領域外，在化學領域等對于化學分子結構觀察中也有很好的應用。